第三十四届全国青少年科技创新大赛

基于酵母模型的合作起源初探

以两种不同糖代谢类型的酵母菌株为模型

华东师范大学第二附属中学付愉

指导教师吕秀华曹张军

一、研究背景

我在吃饭的时候听人聊起:其实微生物的种群与人类社会有一定相似性，突然想到可不可以把微生物置于某些特定的情况下，看看其发展是否符合人类社会的规律;或是利用微生物模拟人类社会研究一些社会学问题呢?我就想到了在科普书上读到过的生物种群间的合作问题。

生物种群间的合作行为一直是进化生物学的经典问题，Science杂志将人类合作的起源列为 125个前沿问题之一。其中一个核心问题是合作系统的稳定性，在合作的过程中，参与合作的“合作者”势必承担合作代价。根据自然选择学说，相对于坐享其成的“欺骗者”，“合作者”必然会处于劣势地位，“欺骗者”在种群中的比例会大大上升，导致合作系统不稳定(公地悲剧)。那么在稳定的合作系统中，合作行为是如何在自然选择过程中显示出对欺骗者的优势的呢?

经过查阅文献我得知，酵母菌可以直接以葡萄糖作为碳源，不能以蔗糖为碳源，但可以分泌一种蔗糖酶，将蔗糖转化为葡萄糖。基于此我构建了一个微生物模型:以正常的酵母作为“合作者”，以敲除控制合成蔗糖酶基因的缺陷株酵母为欺

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一等奖

骗者，并将其混合培养，探究猜想的因素:合作者和欺骗者的比例、初始公共资源数量对合作系统最终结局的影响，尝试对合作的起源这一大课题有更深的思考。

二、研究内容及科学性探究流程

本实验首先通过文献阅读和自身思考建立微生物模型描述一个合作情境;通过查阅文献得知广西大学杜丽秦教授课题组在进行 $\Delta$ SUC2基因缺失酵母MYA1168的相关研究，故通过邮件取得帮助;由于“欺骗者”MYA1168不带有荧光蛋白，拟将导入mCherry红色荧光蛋白，但荧光强度不稳定，故目前实验中只有“合作者”Zim17-GFP带有荧光蛋白;测定了Zim17-GFP荧光蛋白与光密度间的标准曲线，为后续实验荧光强度与稀释倍数间的计算奠定基础。

正式实验分为两块:单独培养实验和混合培养实验。单独培养实验中将“合作者”和“欺骗者”分别在无葡萄糖、含0.5%葡萄糖和含2%葡萄糖的培养基中培养(所有培养基中蔗糖浓度均为2%)，测定生长曲线，确认模型的合理性;混合培养实验中将“合作者”和“欺骗者”以不同的初始比例分别在无葡萄糖、含0.5%葡萄糖和含2%葡萄糖的培养基中(所有培养基中蔗糖浓度均为2%)混合培养，通过 $OD_{600}$ 监测种群生长情况，测定了“合作者”的荧光强度变化曲线，并基于酵母种群的生长情况及“合作者”的生长情况定性推断“欺骗者”的生长情况。

科学性探究流程见图1。

三、实验方法与步骤

(一)酵母合作模型的设计

在本实验中，笔者利用酵母建立了一个简单的合作模型，试图研究在进化的过程中合作者们如何显示出对于欺骗者们的优势。

其中，“合作者”为带有绿色荧光蛋白的野生型酵母Zim17-GFP，能分泌蔗糖酶，将环境中的蔗糖转化为可直接利用的葡萄糖，已有前人证明在此过程中的大部分葡萄糖会排入环境中，即成为“公共物品”。基于酵母的繁殖能力与其享受的代谢收益呈正比，本实验中通过测定“合作者”Zim17-GFP在加有足量蔗糖但初始葡萄糖浓度不同的培养基中对数生长期的生长速率证明了“合作者”Zim17-GFP会为生产“公共物品”付出“代价”。“欺骗者”为 suc2基因缺失株MYA1168，该菌株缺失控制蔗糖酶表达的基因 suc2，因此只能直接利用环境中的

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葡萄糖而无法分解蔗糖。

本实验通过计算将“合作者”与“欺骗者”以不同的初始比例进行混合，并在含有足量蔗糖、不同初始浓度葡萄糖下培养。通过 OD值测定种群的生长曲线，通过测定“合作者”的荧光强度得到“合作者”的生长情况。

(二)模型菌株的构建

1.合作者酵母的构建

(1)合作者酵母的获取。由于本模型中合作者指能正常生产蔗糖酶的酵母，因此选用 Zim17-GFP菌株。由于该菌株的染色体上带有 GFP绿色荧光蛋白基因，欲通过荧光强度检合作者的菌量，因此下面测定合作者荧光强度对 OD值的标准曲线。

(2)合作者荧光强度对 OD值标准曲线的测定。将 Zim17-GFP(合作者)和MYA1168(欺骗者)分别接入含 2%葡萄糖的纯化学培养基, 30℃、 225rpm培养12h,在 2mL离心管中稀释 2倍、 4倍、 8倍、 16倍，取样于 96孔板中，使用多功能酶标仪检测其荧光强度，绘制Zim17-GFP荧光强度对于光密度的标准曲线，同时考察MYA1168菌株的存在对于绿色荧光的影响。

2.欺骗者酵母的构建

(1)欺骗者酵母的获取。本模型中欺骗者酵母指缺失蔗糖酶基因 suc2的缺陷

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微生物学

一筹奖

株酿酒型酵母,该酵母为 MYA1168,购于美国 ATCC菌种库。

(2)欺骗者酵母的标记。A.引物设计:使用SnapGene软件设计mCherry红色荧光蛋白同源重组片段引物，以URA3为筛选标记基因。由生工生物有限公司合成。B.PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳:通过PCR扩增相连片段间具有同源重组序列的片段，并通过琼脂糖凝胶电泳进行筛选。C.酵母转化实验与筛选:将重组片段导入酵母，利用酵母自身的同源重组能力，实现mCherry基因的导入。同源重组基因为HO基因。

(三)模型科学性的验证一单独培养实验

竞争博弈实验中所用的化学培养基配方如表1所示。

表1实验所用纯化学培养基配方

|成分名称|工作液(mg/100g水)|母液(mg/100g水)|
|---|---|---|
|酵母氮源培养基(NYB)|670|6700|
|CSM-his|77|770|
|L-组氨酸|2|20|
|蔗糖|2000|20000|
|葡萄糖|0/500/2000|0/5000/20000|

将两种酵母以 0.10 OD的初始光密度分别在含足量蔗糖,葡萄糖量为 0、0.5%、 $2\%$ 的纯化学培养基中 $30^{\circ} C、 225 rpm$ 培养 36h,每隔 3h使用 96孔板取样,酶标仪 $\left(OD_{600}\right)$ 测定 OD值。

(四)主体实验——竞争合作实验

$$\left\{\begin{array}{l} V1 O D1+V2 O D2=V3 O D3\\ \left(V1 O D1\right):\left(V2* O D2\right)=X\end{array}\right.$$

通过上述自创公式计算,将两种酵母以 5: 1、 2: 1、 1: 1、 1: 2、 1: 5的初始比例混合,整个种群光密度为 0.10 D,分别在含足量蔗糖,葡萄糖浓度为 0、0.5%、2%的纯化学培养基中 30℃、225rpm培养 36h,每隔 3h使用 96孔板取样,前 9h不稀释; 9~15 h稀释 4倍; 18~27 h稀释 8倍; 30 h以后稀释 10倍。酶标仪(OD600)测定 OD值,多功能酶标仪测定荧光强度(激发波长 485nm、发射波

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长 528nm)，测试前振荡 120s混匀。

四、结果与讨论

(一)合作者荧光强度标准曲线的测定

合作者的荧光强度使用二次函数关系拟合精度较高 $(y=5070.1 x^2+10313 x-$ 2320.7, $R^2=0.9911$ ),但由于本实验中主要涉及定性分析,故为了简化计算近似采用线性拟合: $y=17790 x-4309, R^2=0.9846$ 。

基于曹国珍等人的研究, $OD{600}$ 值在 0.2~0.8的可信范围内时, $OD{600}$ 值与细胞数量之间线性关系良好; $OD_{60}$ 值和稀释倍数是乘幂关系，但由于本实验中所采用的稀释倍数较小(4倍、8倍、10倍)，故在计算时近似为线性关系。

基于以上考察，在计算时近似认为合作者的荧光强度与稀释倍数成正比。

(二)欺骗者酵母的标记

尽管在荧光显微镜看到 HO:: mcherry同源重组的 MYA1168菌株表达红色荧光，但在测定过程中发现 MYA1168HO:: mcherry生物量与红色荧光强度不能呈现线性关系。推测可能原因为实验所用的CMV启动子在酵线中为弱启动子，而达不到使用仪器的灵敏度，易产生较大误差，因此后期试验中暂时仅测定合作者的荧光强度。拟进一步改进启动子或找更高级设备再进行欺骗者荧光强度的测定。

(三)模型科学性验证一单独培养实验

1.“合作者”在不同葡萄糖浓度下的生长情况

“合作者”在含葡萄糖组的对数生长期(12~24h)的生长速率略大于无葡萄糖组,提示分解蔗糖虽然可以维持合作者的生长,但仍会对其造成负担,与合作模型中“合作者生产公共物品需要付出一定代价”的前提一致，部分验证了本课题酵母合作模型的科学性。

2.欺骗者在不同葡萄糖浓度下的生长情况

欺骗者的生长速率和平台期的菌量与环境中葡萄糖浓度呈正相关，无葡萄糖浓度组中欺骗者的生长近乎停止。提示欺骗者的生长须依赖环境中的葡萄糖，但无法自己分解蔗糖，部分验证了本课题中酵母合作模型的科学性。

而欺骗者在 0.5%浓度的葡萄糖中虽然生长，但生长速率及平台期菌量明显低于 $2\%$ 葡萄糖浓度组，提示 $0.5\%$ 的葡萄糖是不足量的。

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(四)主体实验一竞争合作实验

1.探究环境初始葡萄糖量对合作行为的影响

为了研究种群竞争合作行为，以两种不同糖代谢类型的酵母菌株初始占比差异及环境中葡萄糖量为变量，将二者混合培养，并测定生长情况。

可以看出，“合作者”在平台期的荧光强度大体上随初始葡萄糖量的下降呈上升趋势。整个酵母种群在平台期的生物量大体上随初始葡萄糖量的下降呈下降趋势，说明当环境中的公共物品越少，对种群生长越不利;而葡萄糖含量越少，酵母种群达到平台期时“合作者”在种群中所占比例越高，提示在混合人口中，越是恶劣的、缺乏“公共物品”的环境，“合作者”的适应度越高。

2.探究合作者和欺骗者初始比例对合作行为的影响

无论是合作者还是欺骗者，当环境中初始葡萄糖量不足时，其生长情况与其初始占比呈负相关。就好像系统在调节二者比例，提示系统可能有一个平衡点，且达到该平衡点时的二者比例只与环境中的初始葡萄糖量有关，与二者初始比无关，而这个平衡点将会是本课题中合作情境的纳什均衡点，从而提示可以得到博弈论解释合作起源的实验证据。然而该平衡点仅仅是笔者的推测，还需重新标记欺骗者后获得更精确的数据，结合定量计算加以验证。

我们增大环境中初始葡萄糖量，由原先的无葡萄糖到2%的过量葡萄糖。可以看出之前的结论仍然成立，除了合作者和欺骗者的初始占比为5:1时，合作者的比生长速率突然下降，提示在不利于合作的环境中(即公共物品充足的环境)，合作者的初始占比过少会阻碍系统的调节。

专家评语

本项目构思巧妙，推论严谨，实验方法与数据分析科学性强。研究者答辩思路清晰，展现出很高的原创思维能力与科学素养。这是一个创新性、科学性、实用性均高的青少年科学项目。本项目虽对资源“丰富/多”与“稀缺/少”的情况进行了初步性探讨，但还可细化。建议使用多种计算模型与统计学方法。